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Dispositivi Lateral Flow

DISPOSITIVI LATERAL FLOW

I dispositivi lateral flow (LFD), spesso denominati “strip”, sono metodi analitici immunocromatografici. I reagenti si trovano normalmente incorporati nel dispositivo, rendendo le strip idonee per un’analisi da campo, grazie alla loro praticità d’uso da parte di chiunque e in qualunque situazione. Sono spesso meno precisi di altre metodiche di screening basate su saggi immunologici come gli ELISA, ma possono essere sufficientemente sensibili, quantitativi ed accurati quando appoggiati ad un sistema di lettura strumentale.

Un tipico LFD è formato da un sample pad dove viene deposto il campione, un conjugate pad in cui è adsorbito il tracciante, una membrana dove avviene la reazione di legame del saggio sul quale ci sono due siti attivi, uno per il test e uno di controllo, ed infine da un absorbent pad responsabile del direzionamento del flusso attraverso la membrana. Quando il campione viene caricato sul sample pad, si muove verso il conjugate pad dove solubilizza il tracciante (generalmente un anticorpo anti-analita adsorbito a particelle di oro colloidale). Il flusso del liquido si muove per capillarità attraverso la membrana verso le zone dove sono depositati i reagenti anidri delle due linee reattive.


Schema esemplificativo di un generico dispositivo lateral flow.

In un saggio di tipo a sandwich, la linea del test è costituita da anticorpo di cattura, in un saggio di tipo competitivo è un coniugato analita-proteina definito competitor. Quando il campione non contiene il contaminante di interesse, nel saggio di tipo non competitivo (ad esempio, i dispositivi per GMO o per microrganismi patogeni) non vi sarà sviluppo di colore sulla linea del test, in quanto l’anticorpo marcato con oro colloidale fluirà sopra quello adsorbito sulla membrana senza che si verifichi alcuna attività di binding. Al contrario, se il campione è contaminato, si forma un complesso analita – anticorpo – oro colloidale che viene riconosciuto dall’anticorpo della linea di test e qui precipita, formando una banda colorata di intensità proporzionale alla concentrazione di contaminante nel campione. I test di tipo competitivo sono sviluppati per rilevare contaminanti a peso molecolare minore, quali micotossine e residui di farmaci veterinari. Se nel campione non è presente l’analita di interesse, allora l’anticorpo marcato con oro colloidale lega il coniugato della linea di test e precipita formando una banda colorata. Se invece il campione contiene il contaminante, questo sequestra l’anticorpo riducendone la capacità di legarsi alla linea di test, con la conseguente riduzione dell’intensità della banda colorata. Grazie all’absorbent pad, il flusso di liquido continua anche quando la membrana è completamente umida verso la linea di controllo, costituita in entrambi i design di saggio da anticorpi di cattura che legano il tracciante indipendentemente dalla concentrazione dell’analita nel campione. Nel caso in cui la linea di controllo non si sia colorata al termine del saggio, il test è da considerarsi non valido.


Risultato ottenuto per un campione negativo con test di tipo competitivo.
Risultato ottenuto per un campione positivo con test di tipo competitivo.

Un vantaggio importante dei dispositivi lateral flow è la loro maggiore stabilità e la loro shelflife spesso migliore dei saggi in micropiastra di tipo ELISA, grazie all’assenza di enzimi o altri bio-reagenti liquidi. Inoltre, i risultati sono meno sensibili alle variazioni di temperature poiché non sono determinati da alcuna attività enzimatica ed avvengono in tempistiche minori. Le line di test e di controllo sono visibili chiaramente ad occhio nudo. Per evitare però differenze nell’interpretazione soggettiva del risultato e per consentire la quantificazione del campione è necessario impiegare appositi lettori (rifrattometri).


SAGGI DI TIPO ELISA

L’ELISA (Enzime Linked ImmunoSorbent Assay) è un saggio basato sull’alta specificità di legame degli anticorpi per la struttura tridimensionale molecolare di un analita o di una famiglia di molecole. Il legame tra antigene ed anticorpo avviene generalmente nei pozzetti di una micropiastra e la reazione di immunobinding è rivelata mediante misurazione dell’intensità del colore sviluppato da un enzima, generalmente una perossidasi, legato alternativamente all’anticorpo o all’antigene: il cosiddetto “coniugato” o tracciante.

Nella diagnostica agro-alimentare vengono utilizzati sia saggi immunologici competitivi che non-competitivi. I saggi non-competitivi (a sandwich) possono essere applicati alla determinazione di composti ad elevato peso molecolare (macromolecole) o di microrganismi (batteri o virus). I saggi immunologici competitivi sono i più complessi e sono messi a punto per misurare composti a basso peso molecolare, la cui struttura non permette il legame di due anticorpi contemporaneamente. Mentre per gli ELISA non-competitivi il design del saggio è di base sempre lo stesso (anticorpi di cattura nel pozzetto di reazione, anticorpo marcato aggiunto dopo la prima incubazione e lavaggio), per gli ELISA competitivi i design possono essere diversi.

Il design più comune per un ELISA competitivo è quello diretto, in cui gli anticorpi sono adsorbiti al fondo del pozzetto di reazione ed il campione è caricato assieme al tracciante o coniugato. Questo, un complesso tra un enzima e un analogo dell’analita, sarà poi il reagente che genererà il segnale. Nel pozzetto di riferimento, chiamato “B zero” o “zero binding”, non viene caricato analita libero. Tutto il coniugato enzimatico ha quindi la possibilità di legare l’anticorpo specifico e, dopo il lavaggio atto a rimuovere le molecole non legate alla fase solida, per aggiunta di un substrato incolore svilupperà un colore con una certa intensità. In tutti gli altri pozzetti, nei quali sono stati aggiunti gli standard oppure i campioni contaminati, la reazione del coniugato sarà in una certa misura inibita perché parte dei siti di legame degli anticorpi sono saturati dall’analita libero. All’aumentare della concentrazione di analita diminuisce il legame del coniugato alla fase solida e quindi l’intensità del colore sviluppato nel pozzetto.


Schema esemplificativo di un generico saggio diretto, competitivo, di tipo ELISA.

Un design alternativo per un ELISA competitivo quello di tipo indiretto, originariamente descritto in letteratura come IEMA. In questo tipo di saggio viene adsorbito sul fondo dei pozzetti della micropiastra l’antigene anziché l’anticorpo. Nel pozzetto di “B zero”, il segnale massimo sarà indotto dal legame di un complesso anticorpo-enzima all’antigene, senza che ci sia inibizione alcuna. In tutti gli altri pozzetti gli analiti liberi (standard e campioni contaminati) si legheranno con parte degli anticorpi, riducendo così la quantità di enzima che lega la fase solida. Il lavaggio rimuove le molecole in soluzione e l’aggiunta di substrato permette di rilevare l’attività dell’enzima legato al fondo del pozzetto, inversamente proporzionale alla concentrazione di analita libero in soluzione.

Sia l’ELISA diretto che quello indiretto possono essere messi a punto utilizzando un solo anticorpo specifico anti-analita oppure impiegando un anticorpo secondario anti-specie. Nell’ELISA diretto, la fase solida è costituito dall’anticorpo secondario; nel pozzetto sono quindi aggiunti in soluzione standard o campione, coniugato e anticorpo specifico anti-analita, la cui porzione costante è riconosciuta dall’anticorpo anti-specie. In questo tipo di saggio, un solo reagente in più deve essere aggiunto nel pozzetto e il test necessita comunque di un solo lavaggio.



Esempio di un generic saggio diretto di tipo ELISA a doppio anticorpo.

Nel caso dell’ELISA indiretto, la versione con il doppio anticorpo ha bisogno di un’implementazione del saggio più lunga. Una prima incubazione prevede solo la formazione del nucleo di legame, ovvero la competizione in fase liquida da parte di antigeni liberi e immobilizzati per il sito di legame dell’anticorpo specifico. Dopo un primo lavaggio, gli anticorpi legati al fondo dei pozzetti sono riconosciuti da anticorpi secondari coniugati con un enzima. Segue un secondo lavaggio e l’aggiunta del substrato cromogeno, per un totale di tre incubazioni e due lavaggi.

È chiaro che sia la precisione che l’accuratezza del liquid handling, così come la qualità dei lavaggi sono molto importanti per ottenere risultati dei test coerenti e riproducibili.

Alla fine del processo l’intensità del colore (assorbanza) per ogni pozzetto è misurata da un fotometro. Si tratta normalmente di un lettore di micropiastre il cui computer può calcolare la concentrazione dell’analita nei campioni interpolando i valori d’assorbanza con quelli di una curva di calibrazione, che può essere una curva di riferimento del lotto oppure una curva implementata nella stessa seduta analitica dei campioni.



COLONNE DI IMMUNOAFFINITÀ

Le colonne di immunoaffinità (IAC) sfruttano il legame specifico anticorpo-analita. Lo scopo di questi dispositivi è consentire una purificazione del campione raccogliendo esclusivamente il contaminante di interesse e rimuovendo gli interferenti che possono generare rumore di fondo nell’analisi, sia di screening che strumentale (metodiche cromatografiche). Le colonne di immunoaffinità contengono un letto di gel sul quale sono stati immobilizzati anticorpi specifici per l’analita di interesse. Versando quindi il campione in colonna, gli anticorpi ritengono solo la molecola di interesse lasciando defluire gli interferenti nel flow through. Mediante l’aggiunta di un’opportuna soluzione eluente, l’analita è rilasciato dagli anticorpi e recuperato.